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2025-07-28 14:00:52
【导语】近日，上海师范大学生命科学学院芦银华研究员团队在《中国科学：生命科学》英文版上发表了重要研究成果。该研究首次在非模式工业放线菌——刺糖多孢菌中，成功建立了基于内源I-B型CRISPR/Cas系统的高效基因组编辑工具。这一突破不仅解决了刺糖多孢菌长期面临的遗传操作难题，还为其他难以改造的工业微生物提供了新的编辑思路。刺糖多孢菌是生产环境友好型杀虫剂多杀菌素的关键菌株，该研究成果有望推动其高产育种进程，提升生物农药的生产效率。
近日，上海师范大学生命科学学院芦银华研究员团队在《中国科学：生命科学》英文版发表重要研究成果，首次在非模式工业放线菌中建立了一种基于内源I-B型CRISPR/Cas系统的高效基因组编辑工具，解决了工业放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）长期面临的遗传操作难题，也为其他难以改造的工业微生物提供了新思路。
刺糖多孢菌是生产绿色生物农药多杀菌素的重(zhòng)要(yào)工(gōng)业(yè)菌(jūn)株(zhū)。多(duō)杀(shā)菌(jūn)素(sù)具(jù)有(yǒu)高(gāo)效(xiào)、广(guǎng)谱(pǔ)的(de)杀(shā)虫(chóng)活(huó)性(xìng)，且(qiě)哺(bǔ)乳(rǔ)动(dòng)物(wù)细(xì)胞(bāo)毒(dú)性(xìng)低(dī)、安(ān)全性(xìng)高(gāo)，是(shì)一(yī)种(zhǒng)“环(huán)境(jìng)友(you)好(hǎo)型(xíng)”杀(shā)虫(chóng)剂(jì)。然(rán)而(ér)，刺(cì)糖(táng)多(duō)孢(bāo)菌(jūn)转(zhuǎn)化(huà)效(xiào)率(lǜ)低(dī)、遗(yí)传工具匮乏，导致其(qí)代(dài)谢(xiè)工(gōng)程(chéng)改(gǎi)造(zào)困(kùn)难(nán)重(zhòng)重(zhòng)，产(chǎn)能(néng)瓶(píng)颈(jǐng)难(nán)以(yǐ)解(jiě)决(jué)。依(yī)赖(lài)外(wài)源(yuán)CRISPR/Cas9系(xì)统(tǒng)的(de)基(jī)因(yīn)组(zǔ)编(biān)辑(ji)技(jì)术(shù)虽(suī)然(rán)已(yǐ)在(zài)诸(zhū)多(duō)物(wù)种(zhǒng)取(qǔ)得(de)突(tū)破(pò)，但(dàn)针(zhēn)对(duì)工(gōng)业(yè)微(wēi)生(shēng)物(wù)，依(yī)然(rán)面(miàn)临转化效率低、宿主毒性强等问题，难以广泛应用。研究团队另辟蹊径，巧用细菌“原生剪刀”——内源I-B型CRISPR/Cas系统，通过生物信息学分析和实验验证，确定了该系统识别的PAM序列（基因切割的“定位信号”）（图(tú)1）。通(tōng)过(guò)重(zhòng)编(biān)程(chéng)靶(bǎ)向(xiàng)自(zì)身(shēn)基(jī)因(yīn)组(zǔ)的(de)微(wēi)型(xíng)CRISPR阵(zhèn)列(liè)，建(jiàn)立(lì)新(xīn)型(xíng)编(biān)辑(ji)工(gōng)具(jù)，成(chéng)功(gōng)实(shí)现(xiàn)高(gāo)效(xiào)的(de)基(jī)因(yīn)敲(qiāo)除(chú)。该(gāi)方(fāng)法(fǎ)无(wú)需(xū)导(dǎo)入(rù)外(wài)源(yuán)Cas蛋(dàn)白(bái)，编(biān)辑(ji)质(zhì)粒(lì)更(gèng)小(xiǎo)、毒(dú)性(xìng)更(gèng)低(dī)。
图1. 刺糖多孢菌内源Type I-B型CRISPR/Cas系统。
（A）刺糖多孢菌内源CRISPR/Cas系统组成及转录分析。（B）I-B型CRISPR/Cas系统组成的Cascade复合体在crRNA引导下靶向DNA示意图。Cascade复合体由Cas11、Cas8、Cas7、Cas6、Cas5等蛋白组成。在PAM被Cas8识别后，Cascade结合到目标DNA上，招募Cas3在原间隔区内切割目标DNA的非靶向链。（C）WebLogo显示的介导CRISRP/Cas系统DNA切割功能的可能PAM序列。
另外，刺糖多孢菌具有多种RM防御系统，如同“分子守卫”般切割外来DNA，导致质粒转化效率极低。研究团队利用新开发的基因敲除工具，逐一敲除关键RM系统，得到(dào)一(yī)株(zhū)转(zhuǎn)化(huà)效(xiào)率(lǜ)显(xiǎn)著(zhe)提(tí)高(gāo)的(de)工(gōng)程(chéng)菌(jūn)株(zhū)，这(zhè)为(wèi)后(hòu)续(xù)的(de)遗(yí)传(chuán)操(cāo)作(zuò)扫(sǎo)清(qīng)了(le)障(zhàng)碍(ài)。在(zài)此(cǐ)基(jī)础(chǔ)上，实现了荧光报告基因mCherry的高效插入，以及长达75 kb的多杀菌素生物合成基因簇的成(chéng)功(gōng)敲(qiāo)除(chú)（图(tú)2）。这(zhè)些(xiē)结(jié)果(guǒ)显(xiǎn)示(shì)该(gāi)工(gōng)具(jù)针(zhēn)对(duì)单基因以及基因簇强大的编辑能力，为刺糖多孢菌高产育种提供了必要的技术支撑。
图2. 基于内源CRISPR系统的高效基因组编辑技术应用于外源基因插入及刺糖多孢菌基(jī)因(yīn)簇(cù)大(dà)片段敲除。
（A）构建敲除质粒，实现对目标基因簇敲除示意图。（B）基因簇敲除菌落PCR鉴定，上图为基因簇外侧引物PCR验证，下图为利用基因簇内部引物PCR验证。（C）基因簇敲除菌株的Sanger测序验证。（D）mCherry插入刺糖多孢菌基因组示意图。mCherry插入菌落PCR鉴定（E）及测序验证（F）。
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